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陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照的體外GTPγS/ GDP蛋白質(zhì)上樣量

注意：體內(nèi)細(xì)胞刺激將激l活可用Arf 6的大約10％，而體外GTPγS蛋白負(fù)載將激l活A(yù)rf 6的將近90％。

1，將0.5 ml每種細(xì)胞提取物等分到兩個(gè)微量離心管中（或使用1 μg純化的Arf 6蛋白）。

2，向每個(gè)試管中加入20 μl 0.5 M EDTA（終濃度為20 mM）。

3，將5 μl 100 XGTPγS（至100 μM，終濃度）加到一個(gè)試管中（陽(yáng)性對(duì)照）。

4，在第二個(gè)試管中加入5 μl 100 X GDP（至1 mM，終濃度）（陰性對(duì)照）。

5，在攪拌下將試管在30°C孵育30分鐘。

6，通過(guò)將試管放在冰上并添加32.5 μl 1 M MgCl2（至60 mM，終濃度）來(lái)停止加載。

Arl3（類似Arf的3）是一種ADP-核糖基化因子（Arf）家族蛋白，在N端延伸方面不同于大多數(shù)Arf家族成員。 Arl3的核苷酸交換是快速的，并且與脂質(zhì)和去污劑無(wú)關(guān)。 與GDT / GTP結(jié)合后，Arl3與一系列效應(yīng)蛋白相互作用，并調(diào)節(jié)這些效應(yīng)蛋白的活性，例如人類視網(wǎng)l膜基因4（HRG4），cGMP磷酸二酯酶的δ亞基（PDEδ）和Arl2的結(jié)合物（BART）。 Arl3還以可調(diào)節(jié)的方式結(jié)合微管，以通過(guò)與色素性視網(wǎng)l膜炎2（RP2）相互作用來(lái)改變胞質(zhì)分裂的特定方面。 有人提出，RP2與Arl3協(xié)同作用，將光感受器中的細(xì)胞膜和細(xì)胞骨架連接為細(xì)胞的一部分

9.收集上清液并在冰上存儲(chǔ)樣品（約1-2 mg總蛋白）以進(jìn)行中間使用，或?qū)⑵淅鋬霾⒈４嬖?70°C下以備將來(lái)使用。

紐斯特生物技術(shù)有限公司推出的Cdc42活性檢測(cè)試劑盒主要是依據(jù)單克l隆抗l體能夠特異性的識(shí)別Cdc42-GTP結(jié)合蛋白，而不識(shí)別Cdc42-GDP結(jié)合蛋白，進(jìn)而簡(jiǎn)單并且快速的進(jìn)行Cdc42的活性檢測(cè)。同時(shí)試劑盒中的Cdc42-GTP單克l隆抗l體也可以進(jìn)行免l疫組化實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞和組織中Cdc42的活性監(jiān)測(cè)。每套試劑盒可以進(jìn)行20次檢測(cè)。

武漢紐斯特生物科技有限公司（WuhanNewEastBiotechonologyCo.Ltd），系美國(guó)生命科學(xué)試劑供應(yīng)商美國(guó)NewEastBio在中國(guó)的子公司。公司位于武漢東湖高新技術(shù)開(kāi)發(fā)區(qū)光谷生物城.美國(guó)NewEastBio專注于生命科學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域，主要產(chǎn)品有小分子、ELISA試劑盒、蛋白等，與世界高校和研究所、世界大制藥公司、生物科技公司和醫(yī)院等客戶建立了長(zhǎng)期穩(wěn)定的合作關(guān)系，產(chǎn)品銷往全球。武漢紐斯特生物將攜手美國(guó)NewEastBio，負(fù)責(zé)美國(guó)品牌NewEastBio產(chǎn)品在中國(guó)市場(chǎng)的推廣、銷售及售后服務(wù)。

測(cè)定原理

NewEast Biosciences Rab35激l活檢測(cè)試劑盒基于特定于配置的抗Rab35 GTP

單克l隆抗l體，用于測(cè)量細(xì)胞提取物中或體外的活性Rab35 GTP水平

GTPγS加載Rab35激l活測(cè)定。 簡(jiǎn)而言之，抗活性Rab35小鼠單克l隆抗l體將是

與含有Rab35-GTP的細(xì)胞裂解液一起孵育。 綁定的活動(dòng)Rab35隨后將被下拉

蛋白質(zhì)A / G瓊脂糖。 沉淀的活性Rab35將通過(guò)免l疫印跡分析使用

抗Rab35兔多克l隆抗l體。