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低溫生物菌種的注意事項

無論采用何種保藏方法，首先應該挑選典型菌種的優良純種來進行保藏，保藏它們的休眠體，如分生孢子、芽孢等。其次，應根據微生物生理、生化特點，人為地創造環境條件，使微生物長期處于代謝不活潑、生長繁殖受抑制的休眠狀態。這些人工造成的環境主要是干燥、低溫和缺氧，另外，避光、缺乏營養、添加保護劑或酸度中和劑也能有效提高保藏效果。

生物有機肥產品生產菌種安全性分析

雖然目前生物有機肥產品生產菌種大多采用植物根際促生菌， 但近年來很多研究發現，芽孢菌屬和類芽孢菌個別菌株能產生菌素。 即便在菌種安全分級目錄中列為一級免做理學試驗的菌種， 如枯草芽孢菌、 多類芽孢菌、 地衣芽孢菌等個別菌株也檢測到部分溶血素基因， 潛在危害不容忽視。 因此， 開展生物有機肥產品生產菌種生物安全風險評價， 從源頭上把好菌種安全關是產品質量安全的首要保障。通過調研發現， 用于生物有機肥產品的部分生產菌種分類地位不明確， 甚至混亂， 難以從源頭上進行安全風險的初步識別 。 以常見生產菌種枯草芽孢菌為例， 實際上是一個表型相似的群體， 包括枯草芽孢菌、 地衣芽孢菌、 短小芽孢菌、解淀粉芽孢菌、 深褐 （萎縮） 芽孢菌、莫哈韋（莫杰夫） 芽孢菌、 死谷芽孢菌、 索諾拉沙漠芽孢菌、 特基拉芽孢菌、暹羅芽孢菌等 10個緣種。生產企業送檢的枯草芽孢菌生物有機肥產品， 經鑒定發現很多產品實際為解淀粉芽孢菌， 且許多菌株具有很強的溶血作用。通過對生產企業調研發現， 部分生產企業選擇分離于動物腸道的解淀粉芽孢菌作為產品生產用菌株， 該類菌種生產發酵周期短、 活菌數量高、 生產成本低， 但產品的應用功效不佳， 溶血風險大 ， 建議慎用。而植物來源的解淀粉芽孢菌溶血風險小， 產品應用效果好， 推薦使用。

低溫生物菌種的液氮冷凍保藏法

(1)準備安瓿管用于液氮保藏的安瓿管，要求能耐受溫度突然變化而不致破碎，因此，需要采用硼硅酸鹽玻璃制造的安瓿管，安瓿管的大小通常使用75×10mm的，或能容1.2mm液體的。

(2)加保護劑與滅菌保存細菌、酵母菌或霉菌孢子等容易分散的細胞時，則將空安瓿管塞上棉塞，1.05kg/cm2，121.3℃滅菌15分鐘:若作保存霉菌菌絲體用則需在安瓿管內預先加入保護劑如10%的甘油蒸餾水溶液或10%二甲亞砜蒸餾水溶液，加入量以能浸沒以后加入的菌落圓塊為限，而后再用1.05kg/cm2>，121.3℃滅菌15分鐘。

(3)接入菌種將菌種用10%的甘油蒸餾水溶液制成菌懸液，裝入已滅菌的安瓿管;霉菌菌絲體則可用滅菌打孔器，從平板內切取菌落圓塊，放入含有保護劑的安瓿管內，然后用火焰熔封。浸入水中檢查有無漏洞。

(4)凍結再將已封口的安瓿管以每分鐘下降1℃的慢速凍結至-30℃。若細胞急劇冷凍，則在細胞內會形成冰的結晶，因而降低存活率。

(5)保藏經凍結至-30℃的安瓿管立即放入液氮冷凍保藏器(圖Ⅶ-14)的小圓筒內，然后再將小圓筒放入液氮保藏器內。液氮保藏器內的氣相為-150℃，液態氮內為-196℃。

(6)恢復培養保藏的菌種需要用時，將安瓿管取出，立即放入38-40℃的水浴中進行急劇解凍，直到全部融化為止。再打開安瓿管，將內容物移入適宜的培養基上培養。

此法除適宜于一般微生物的保藏外，對一些用冷凍干燥法都難以保存的微生物如支原體、衣原體、氫細菌、難以形成孢子的霉菌、噬菌體及動物細胞均可長期保藏，而且性狀不變異。缺點是需要特殊設備。

申請時，有新的低溫生物菌種的必須要辦理菌種保藏嗎？

如果得到了審批權人卻沒有構成的新菌種要件，顯而易見是需要保藏菌種的。發酵飼料原料與配方:配制好的發酵飼料1000公斤，水350-400公斤(夏天350，冬天400)，菌種飼料發酵劑5公斤,100-200克納豆菌。 制作稀釋活化發酵液:將菌種5公斤飼料發酵劑和100-200克納豆菌倒入350-400公斤水中攪拌均勻制成活化發酵液。 將制成的活化發酵液與1000公斤發酵飼料混合均勻，濕度以手捏成團不滴水，一觸即散為宜。有攪拌機的大型養殖場將活化發酵液慢慢加入飼料中攪拌均勻即可;沒有攪拌機的養殖戶將活化發酵液慢慢少量噴到飼料上，用鐵鍬攪拌均勻，注意:不能有團塊、水結塊，用手將團塊、水結塊搓散攪拌均勻。 大型養殖場可以將配置好的飼料在地面壓實堆成垛或者裝入水泥池壓實，用塑料薄膜密封或者使用厚實的不透氣的塑料碎團塊、水結塊。