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發布時間：2021-10-28 02:25
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為什么需要凍存袋？
細胞培養的傳代及日常維持過程中，在培養器具、培養液及各種準備工作方面都需大量的耗費，而且細胞一旦離開活物開始原代培養，它的各種生物特性都將逐漸發生變化并隨著傳代次數的增加和體外環境條件的變化而不斷有新的變化。因此及時進行細胞凍存十分必要。細胞冷凍儲存在-70℃冰箱中可以保存一年之久；細胞儲存在液氮中，溫度達-196℃，理論上儲存時間是沒有限制的。
細胞凍存的操作步驟
1. 配制含10%DMSO或甘油、10～20%小牛血的凍存培養液；
2. 取對數生長期的細胞，去除舊培養液，用PBS清洗。
3. 去除PBS，加入適量胰蛋白酶（覆蓋培養皿表面）把單層生長的細胞消化下來；
4. 離心1000rpm，5min；
5. 去除胰蛋白酶，加入適量配制好的凍存培養液，用吸管輕輕吹打使細胞均勻，計數，調節凍存液中細胞的密度為5×106/ml～1×107/ml；
6. 將細胞分裝入凍存管中，每管1～1.5 ml；
7. 在凍存管上標明細胞的名稱，凍存時間及操作者；
8. 凍存：標準的凍存程序為降溫速率-1～-2℃/ min；當溫度達-25℃以下時，可增至-5℃～-10℃/min；到-100℃時，則可迅速浸入液氮中。也可將裝有細胞的凍存管放入-20℃冰箱2h ，然后放入-70℃冰箱中過夜，取出凍存管，移入液氮容器內。
細胞凍存步驟
1.用移液器吸走原培養基，加入適量PBS洗1-2遍;
2.加入適量胰酶，置于培養箱中消化;
3.待消化到位后加入適量血漿或完全培養基終止消化，800-1000rpm離心3-5min;
4.配制凍存液，待細胞離心后去上清，加入凍存液重懸，調整細胞濃度為3×106~1×107 cells/mL，轉移到凍存管中;
5.將凍存管放入程序降溫盒中，-80度過夜，然后轉移到液氮中保存。
6.凍存細胞后應取出一管復蘇，檢測細胞的存活率。理論上細胞可在液氮內長期保存，
為穩妥起見可在細胞凍存半年后復蘇培養，觀察細胞生長情況，再繼續凍存
