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原位雜交(In Situ Hybridization)也叫原位雜交組化(in situ hybridization histochemistry, ISHH)，是一種固相分子雜交的方法，bai它是用標記的DNA或RNA為探針，在原位檢測組織或細胞內特定核酸序列的方法。探針的種類按所帶標記物可分為同位素標記探針和非同位素標記探針兩大類。常用的同位素標記物有3H、35S、125I和32P，非同位素標記物中目前很常用的有生物素、地高6辛和熒光素三種。探針的種類按核酸性質不同又可分為DNA探針、cDNA探針、RNA探針和合成寡核苷酸探針。

原位雜交術可在原位檢測細胞合成某種多肽或蛋白質的基因表達，有很高的敏感性和特異性，已成為細胞生物學、分子生物學研究的重要手段。

就DNA探針和RNA探針的比較，DNA探針在雜交過程中會出現探針雙鏈之間退火的可能，也更傾向于在溶液中形成大分子的探針聚合體，從而影響其滲透能力。而RNA 探針的應用，將提高DNA-RNA雜交子的熱穩定性。

Tips：RNA探針因其單鏈、高分子結合力、可適應高溫雜交的特性，其檢測特異性和靈敏度均優于DNA探針。常用的RNA探針標記方法為構建質粒后進行轉率合成。通過PCR擴增的方法，可以更方便地進行RNA探針的制備；RNA探針合成后，還需驗證其對目標片段檢測的靈敏度和特異性。

原位雜交組織（或細胞）化學技術簡稱原位雜交（In situ hybridization, ISH）是應用已知堿基順序并帶有標記物的核酸探針與組織細胞內待測的核酸，按堿基互補配對原則進行特異性結合，形成雜交體，然后用與標記物相應的檢測系統，通過組織化學或免3疫組織化學方法在核酸原有位置進行細胞內定位、定性和定量研究。為分子水平研究細胞內基因表達及有關細胞5因子的調控提供了有效的工具。可視為組織化學與免3疫組織化學的重大突破。

原位雜交不需要從組織中提取核酸，對于組織中含量極低的靶序列有極高的敏感性，并可完整地保護組織和細胞的形態，更能準確地反映出組織細胞的相互關系及功能狀態。

在條件都得到滿足的情況下，雜交的成敗就取決于保溫時間。時間短了，雜交反應不完成；時間長了也無益，會引起非特異結合增多。一般雜交反應要進行20h左右。1966年Britten和Kohne推薦用Cot =值來計算雜交反應時間。Cot 值實際上是雜交液中單鏈起始濃度（Co）和 反應時間（t）的乘積。實驗表明Cot =100時，雜交反應基本完成。Cot=0，基本上沒有雜交。例如在液相雜交中未標記的DNA 400μg/ml（按單股DNA每微克 紫外吸收值為0.024計算，總的吸收值為 9.6），如果反應時間為21h，那么對于未標記的DNA來說，Cot =9.6/21 =100.8,，雜交完成了。對標記DN A（濃度為0.1μg/ml）來說Cot值為0.05，這就充分排除了標記DNA的自我復性。Tm值25℃時雜交zui佳，所以首先要根據公式（4）計算雜交體Tm 值。由此式可見，通過調節鹽濃度、甲酰胺濃度和雜交溫度來控制所需的嚴格性。