液相色譜儀品牌常用指南 武漢賽爾夫科技公司

反相色譜(RPC)是指利用非極性的反相介質(zhì)為固定相，極性有機(jī)溶1劑的水溶液為流動相，根據(jù)溶質(zhì)極性(疏水性)的差別進(jìn)行溶質(zhì)分離與純化的洗脫色譜法。與HIC一樣，RPC中溶質(zhì)也通過疏水性相互作用分配于固定相表面，但是，RPC固定相表面完全被非極性基團(tuán)所覆蓋，表現(xiàn)出強(qiáng)烈的疏水性。因此，必須用極性有機(jī)溶1劑或其水溶液進(jìn)行溶質(zhì)的洗脫分離。溶質(zhì)在反相介質(zhì)上的分配系數(shù)取決于溶質(zhì)的疏水性，一般疏水性越大，分配系數(shù)越大。分配色譜是利用溶液中被分離物質(zhì)在兩相中分配系數(shù)不同，以使組分分離。當(dāng)固定相一定時(shí)，可以通過調(diào)節(jié)流動相的組成調(diào)整溶質(zhì)的分配系數(shù)。RPC主要應(yīng)用于相對分子質(zhì)量低于5000，特別是1000以下的非極性小分子物質(zhì)的分析和純化，也可以用于蛋白質(zhì)等生物大分子的分析和純化。由于反相介質(zhì)表面為強(qiáng)烈疏水性，并且流動相為低極性的有機(jī)溶1劑，生物活性大分子在RPC分離過程中容易變性失活，所以，以回收生物活性蛋白質(zhì)為目的時(shí)，應(yīng)注意選用適宜的反相介質(zhì)。

柱色譜為向玻璃管中填入固定相，以流動相溶劑浸潤后在上方倒入待分離的溶液，再滴加流動相，因?yàn)榇蛛x物質(zhì)對固定相的吸附力不同，吸附力大的固著不動或移動緩慢，吸附力小的被流動相溶劑洗下來隨流動相向下流動，從而實(shí)現(xiàn)分離。紙色譜以濾紙條為固定相，在紙條上點(diǎn)上待分離的混合溶液的樣點(diǎn)，將紙條下端浸入流動相溶劑中懸掛，溶劑因?yàn)槊?xì)作用沿濾紙條上升，樣點(diǎn)中的溶質(zhì)從而被分離。薄層色譜是在玻璃板上涂以固定相涂層，然后點(diǎn)樣，下端浸入溶劑，同樣自下而上分離。另外，如果在很低的溫度下，基線信號值明顯的大于初始值，那么有可能是色譜柱和GC系統(tǒng)有污染。常用于探索柱色譜實(shí)驗(yàn)條件，溶劑和固定相的選擇等。常用固定相有石膏、氧化鋁、蔗糖、淀粉等，常用流動相為水、等各種。

柱色譜法( Column chromatography)所用色譜管為內(nèi)徑均勻、下端縮口的硬質(zhì)玻璃管，下端用棉花或玻璃纖維塞住，管內(nèi)裝有吸附劑。色譜柱的大小，吸附劑的品種和用量，以及洗脫時(shí)的流速，均按各單體中的規(guī)定。吸附劑的顆粒應(yīng)盡可能保持大小均勻，以保證良好的分離效果，除另有規(guī)定外通常多采用直徑為0.07-0.15mm的顆粒。吸附劑的活性或吸附力對分離效果有影響，應(yīng)予注意。吸附劑的填裝 干法：將吸附劑一次加入色譜管，振動管壁使其均勻下沉，然后沿管壁緩緩加入開始層析時(shí)使用的流動相，或?qū)⑸V管下端出口加活塞，加入適量的流動相，旋開活使流動相緩緩滴出，然后自管頂緩緩加入吸附劑，使其均勻地潤濕下沉，在管內(nèi)形成松緊適度的吸附層。操作過程中應(yīng)保持有充分的流動相留在吸附層的上面。濕法：將吸附劑與流動相混合，攪拌以除去空氣泡，徐徐傾入色譜管中，然后再加入流動相，將附著于管壁的吸附劑洗下，使色譜柱表面平整。俟填裝吸附劑所用流動相從色譜柱自然流下，液面將柱表面相平時(shí)，即加試樣溶液。試樣的加入 除另有規(guī)定外，將試樣溶于層析時(shí)使用的流動相中，再沿色譜管壁緩緩加入。有機(jī)溶1劑梯度的大小也會影響分辨率，一般梯度越小，分辨率越大。注意勿使吸附劑翻起。或?qū)⒃嚇尤苡谶m當(dāng)?shù)娜軇┲小Ｅc少量吸附劑混勻，再使溶劑揮發(fā)去盡后使呈松散狀；將混有試樣的吸附劑加在已制備好的色譜柱上面。如試樣在常用溶劑中不溶解，可將試樣與適量的吸附劑在乳缽中研磨混勻后加入。洗脫 除另有規(guī)定外，通常按流動相洗脫能力大小，遞增變換流動相的品種和比例，分別分部收集流出液，至流出液中所含成分顯著減少或不再含有時(shí)，再改變流動相的品種和比例。操作過程中應(yīng)保持有充分的流動相留在吸附層的上面。

如何預(yù)防液相色譜儀液相泵的故障：　　要保持泵的良好操作性能，必須維護(hù)系統(tǒng)的清潔，保證溶劑和試劑的質(zhì)量，對流動相進(jìn)行過濾和脫氣.下面列出預(yù)防泵故障的幾項(xiàng)措施：　　1、用高質(zhì)量試劑和HPLC級溶劑；　　2、過濾流動相和溶劑；　　3、脫氣；　　4、每天開始使用時(shí)放空排氣，工作結(jié)束后從泵中洗去緩沖液；　　5、不讓水或腐蝕性溶劑滯留泵中；　　6、定期更換墊圈；　　7、需要時(shí)加潤滑油；　　8、查閱有關(guān)泵操作手冊中的其它建議。　　處于良好操作狀態(tài)的泵，應(yīng)該能使色譜圖上的基線平穩(wěn)；保留時(shí)間的重復(fù)性好。在等度洗脫時(shí)壓力波動小于2%。梯度洗脫時(shí)壓力變化應(yīng)是緩慢和平穩(wěn)的。　　為了使故障發(fā)生后盡除，平時(shí)應(yīng)常備密封、單向閥、泵頭裝置、各式接頭、保險(xiǎn)絲等部件，以及更換工具。以前填料純化技術(shù)不是很成熟，十八烷基鍵合到硅膠表面不是很完全，硅膠上總是少量的硅羥基在外面。